光片顯微鏡的前世今生 - 分析行業新聞

光片熒光顯微鏡（Light Sheet Fluorescence Microscopy, LSFM）的概念產生于1903年，但此后很長時間并無太多發展。上世紀九十年代，華盛頓大學的Francis Spelman實驗室為了對小鼠毛細胞的結構和耳蝸的其他特性進行定量測量，發展了一系列實驗方法。實驗室研究人員受到前人使用側向光片照明觀察表面結構的啟發，發明了正交平面熒光光學切片裝置（orthogonal plane fluorescence optical sectioning, OPFOS），并**次獲得了整個耳蝸的清晰熒光圖像(1) (2) (3)。2004年，SPIM（Single plane illumination microscopy ）文章的發表大大促進了光片顯微鏡的發展和使用(4)，文章強調了其用于胚胎發育研究的實用性，并給出了青鳉神經節細胞搏動以及果蠅胚胎發育長時間成像的熒光圖像。 2010年，在**屆光片熒光顯微鏡研討會上，研究者們決定將LSFM作為這一類顯微鏡的統一名稱(5)。后續又出現了很多形式的光片顯微鏡，如掃描光片(6)、雙光子掃描光片(7)和bessel beam(8)、lattice(9)等新式光片顯微鏡。這些方法不斷改善光片顯微鏡的成像分辨率、穿透深度和成像視野，以期滿足生物學發展的需要。

光片顯微系統成像原理

光片顯微系統使用一層光束從樣品側面激發熒光樣品，使用CCD或SCMOS進行檢測，照明光路和熒光檢測光路互相垂直。由于樣品受激發的平面就是成像平面，不存在離焦激發，可以自動獲得光學切片，從而將光漂白和光學損傷降到*低。光片顯微系統使用CCD或SCMOS成像，速度通常為每秒幾十幀，甚至上百幀，所以通過在光片下移動樣品使入射光束激發不同的平面，可以很容易又非?？焖俚牡玫秸麄€組織的3D圖傳統共聚焦的激發和檢測是同一個方向，整個照射區域都處于被激發狀態，沒有被檢測的區域經過長時間的照射易被淬滅，無法保證幾天的記錄；另外共聚焦使用點掃描成像，速度相對較慢。

光片熒光顯微鏡與共聚焦顯微鏡的區別

2015年，Leica推出了自己的光片系統，該系統使用獨特的 TwinFlect 反光鏡裝置使激發光束從左右兩個方向入射到樣品上，照明均勻，保證了細胞水平的分辨率。成像速度快、分辨率高和光毒性低的特點可使樣品在該系統中保持其生物活性，完成數小時乃至數天的長時間活體生物培養及成像。另外，Leica光片系統以共聚焦為基礎，可以實現與共聚焦顯微鏡的聯合使用，完成光激活、光轉換等操作及后續追蹤的實驗。

Leica光片顯微系統常見應用

• 胚胎與小型生物(如模式動物斑馬魚、線蟲、果蠅等，植物擬南芥等)發育過程中的快速三維成像，例如：細胞遷移、心臟及血管發育、神經發育等。

• 三維細胞培養、球體和囊腫、組織培養、器官培養的實時成像。

• 結合共聚焦或雙光子激光顯微鏡，完成光學刺激與追蹤的功能，觀察和實驗方式更為靈活多樣。

1. 快速3D成像

斑馬魚血管系統3D重構

2. 活體快速長時間3D成像，捕捉整個動態過程

高速成像：斑馬魚跳動的心臟

果蠅背部閉合過程

3. **可以結合共聚焦和光片的系統，實現光學操作的后續追蹤

斑馬魚神經元光轉換(Kaede)后，持續記錄該細胞的運動

斑馬魚尾部，光轉換(Kaede，405 nm)后細胞去修復被多光子激光造成的損傷部位

使用LAS X 3D分析追蹤光轉換的細胞

長時間的圖像采集需要維持樣品的活性，Leica光片系統可加載孵育裝置，為樣品提供良好的生長條件，保持活性。另外整個系統的開放性很高，有更多可操作的空間。

參考文獻

1.Voie AH, Burns DH, Spelman FA.(1993) Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J Microsc. Jun;170(Pt 3):229-36.

2.Voie AH, Spelman FA. (1995) Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections. Comput Med Imaging Graph. Sep-Oct;19(5):377-84.

3.Voie AH. (2002) Imaging the intact guinea pig tympanic bulla by orthogonal-plane fluorescence optical sectioning microscopy. Hear Res. Sep;171(1-2):119-128. Erratum in: Hear Res. 2003 Jul;181(1-2):144.

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6.Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., and Stelzer, E. H. (2008) Reconstruction of zeb rafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science (New York, N.Y 322, 1065-1069

7.Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., and Fraser, S. E. (2011) Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature methods 8, 757-760

8.Planchon, T. A., Gao, L., Milkie, D. E., Davidson, M. W., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., and Betzig, E. (2011) Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nature methods 8, 417-423

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